Beneficial Microbes：体外人类肠道模型在益生元和益生菌的筛选和发展中的应用

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V.T. Pham and M.H. Mohajeri. The application of in vitro human intestinal models on the screening and development of pre- and probiotics. Benef Microbes. 2018 Apr 26:1-18.

▌介绍

人体内有大量的微生物，其中胃肠道是迄今为止最大的定植器官，其包含的不同节段具有不同环境条件和微生物谱，这反映在细菌细胞的分布不均，胃和十二指肠细菌浓度低（每克10^1至10^3个细菌），在空肠和回肠中增加至每克10^4至10^7个细菌，结肠中浓度最高（每克10^11至10^12个细菌）。结肠含有人体中所有微生物的70％以上。消化物质的缓慢流动为细菌提供了发酵来源于饮食和内源性分泌物的未消化的底物以增殖的时间，因此，人类肠道是一个大型、多样化和动态的细菌群落的自然栖息地，迄今为止描述的细菌种类超过1,200种。最近的分析表明，我们体内的细菌数量与人类细胞总数相同，并且含有比人类基因组多100倍的基因。需注意受年龄、性别、饮食、疾病、药物和环境等影响，个体之间的微生物组成存在显着差异。人们早已认识到并记录了这个庞大而动态的细菌群落对宿主健康和疾病的意义及影响。在早年生活中，肠道菌群的定植及代谢与胃肠疾病的病因相关，如婴儿腹痛和坏死性小肠结肠炎。人类肠道微生物群在免疫系统的发育和稳态中发挥着重要作用，并可能与多系统器官衰竭、结肠直肠癌、炎症性肠病（IBD）和肥胖等特定病理状况有关。此外，肠道微生物群与神经系统之间的关系也日益显著。因此，人们有机会通过开发益生菌和益生元干预来调节肠道微生物以获得长期持久的健康。

益生菌被定义为“一种活的微生物，在给予足够剂量时，对宿主健康有益”。益生菌发挥其有益作用的机制包括改变肠道微生物群、竞争并限制病原体的定植、增强上皮屏障功能和调节免疫系统。益生元最初定义为“不易消化的食物成分，通过选择性刺激结肠中一种或少数几种细菌的生长和/或活性对宿主产生有益影响，改善宿主健康”。经过20年的研究，益生元的概念已获得发展，定义已被多次完善。益生元的最新定义是“宿主微生物选择性利用的底物，赋予宿主健康益处”。一些关键性的研究总结了益生元和益生菌在总体健康、结直肠癌、IBD和肥胖中的作用。在这篇综述中，我们讨论了体外肠道模型是作为益生元和益生菌研究的有用方法及最常用模型的优缺点和技术问题。此外，我们对应用这些模型进行益生元和益生菌研究的文献进行了总结。

▌体外人类肠道模型是益生元和益生菌发展的有力工具

在益生元和益生菌的研究中，体外和体内研究之间的整合是必要的，可以互相补充。下面将讨论每种方法的优点和缺点。

人体研究

人体研究可利用粪便样品，它能初步反应胃肠道微生物组成。这种类型的研究还能够建立微生物群组成与宿主表型或环境之间的相关性，产生研究问题，或者可以用来确认在简化模型中观察到的效应或机制。

营养化合物对肠道微生物群的影响可以通过给予人类受试者过量的测试成分来证明，但可能导致不良反应。因此，介于道德及安全问题，这些研究往往受到限制。而且，很难监测和严格遵守介入治疗。新的数据也提供了结肠微生物群能快速适应底物可用性改变的证据。在人体研究中，取样大多限于粪便探针作为终点测量。由于侵入性和不方便操作，从胃肠道不同区域（例如近端结肠）获取样品受到限制，因此难以准确确定起效的部位，及进一步确定益生元和益生菌的作用机制。肠道上皮细胞分泌形成粘液层，将肠腔和宿主组织分开。然而，粘液层的采样是侵入性的，粪便样品的使用无法代表粘膜群落。在人体研究中，由于宿主-微生物群之间不可避免的相互作用，益生元和益生菌对肠道微生物活性的直接影响通常难以解释。人体研究的另一个挑战是由遗传背景、饮食、健康状况、生活方式和环境条件等混杂因素引起的巨大的个体差异。最后，难以确定益生元和益生菌对肠道微生物群组成的影响是通过直接刺激生长或是通过微生物群短链脂肪酸（SCFA）（可降低pH）的产生。

动物研究

动物模型（主要是小鼠、大鼠和小猪）使我们可以在高度控制的环境下调节和研究宿主- 微生物相互作用，从而将人体研究中常见的混杂因素的影响降至最低。其中无菌动物是研究肠道微生物对宿主功能影响的最适合的模型。处死动物后我们可以直接获取结肠内容物，结肠内容物中的细菌代谢物例如SCFA还没有被宿主吸收，因此与使用粪便的研究相比，动物试验更适合于研究肠道微生物群的代谢活性。

最近一项使用新生仔猪模型的研究证明了低聚半乳糖（GOS）对肠道功能的影响，如促进肠道微生物群平衡，改善肠道组织形态和刺激肠道免疫系统。一般而言，动物模型在营养干预例如肠胃外营养、低聚糖、益生元和益生菌的筛选方面具有优势，并能进一步阐明其作用机制和对宿主的影响，鉴定微生物和宿主生物标志物，这些在非侵入性婴儿研究是不可能做到的。然而，动物模型是昂贵的，劳动密集的，并且在生理学上可能不能代表人体代谢。另外，动物的微生物组不同于人类的微生物组，因此，将从动物模型获得的发现转用于人类仍然是一个挑战。

体外肠道发酵模型

为了克服体内研究的这些缺点，人们开发了体外发酵模型，作为在高度控制的条件下研究人类肠道微生物群的有力工具，它使我们能够在模拟不同结肠区域的反应器中随时间动态取样。

与体内研究相比，体外结肠发酵模型更便宜，可重复性更高，不需要经过精心准备伦理批准，并且可以在更短的时间内进行研究。这些模型能够在模拟的生理条件下培养来自粪便样品的人类肠道微生物群。几种模型还可以进一步模拟酶消化活性、粘液生成以及微生物群和宿主之间的相互作用。因此，研究人员能够使用这些系统来研究益生元和益生菌对肠道微生物群的影响、益生元的发酵谱、益生菌在整个胃肠道的生存能力和功能。体外发酵模型不仅可用于筛选和开发不同的益生元及益生菌，还能用于机制研究，并在碳水化合物和蛋白质发酵、类固醇和胆汁酸代谢、氢气形成和清除领域形成假设。

体外发酵的原理是在生理条件下（厌氧生活、保留时间、培养基、温度和pH）将粪便微生物群接种在营养培养基中。最简单的模型是分批发酵，由于底物的快速消耗和pH的降低（抑制微生物活性），适用于短期实验。另一方面，具有不同复杂程度的连续培养可允许长期发酵和参数调整以模拟体内条件。单阶段模型通常模拟近端结肠的条件，而多阶段发酵模型可以模拟结肠的不同区域（近端结肠、横结肠和远端结肠）。

考虑到每种方法的优点和局限性，将体外和动物模型与人体研究相结合设计多尺度的策略可能有助于深入了解肠道微生物群，饮食和宿主之间的复杂关系;并进一步阐明肠道微生物群在健康和疾病中的作用。

▌体外人类肠道模型的重要参数

粪便接种

胃肠道不同区域具有不同环境条件和微生物特征。因此，模拟一个区域（例如近端结肠）的模型最好应接种该特定区域的生物学内容物。然而，收集此类样品需要侵入性的操作，导致了伦理的约束，因此大多数体外结肠发酵模型接种的是粪便样品。尽管如此，理论上通过选择专门的发酵培养基，仍然可以模拟胃肠道中所需区域的条件。需注意，使用粪便样品可能会将额外的未定义的底物引入系统中。为了减少底物污染物的影响，粪便样品经常短暂离心以去除大颗粒。此外，在确定的发酵培养基中分批发酵粪便接种物将进一步促进粪便微生物群适应特定结肠区域的实验条件。

考虑到由性别、饮食、地理位置、种族和年龄引起的粪便供体者之间的个体间差异，来自不同供体的粪便样品在接种到体外系统之前是否应该汇集仍然存在争议。有利于汇集微生物群的争论是汇集可以限制个体间变异性并提供可以重复用于不同发酵的标准化微生物群，便于实验之间的比较。值得注意的是，随着时间的推移，除个体差异之外，同一个供体内的差异也可能导致不同的微生物群组成和代谢活性。此外，汇集粪便样品会增加总体多样性并导致更广泛的肠道微生物谱。最近一项使用TIM-2系统的研究比较了来自单个供体和四个供体的肠道微生物群的稳定性和活性。作者强调了单个供体在多样性和功能方面与多个供体相似，这表明粪便样品的汇集适合用于发酵实验。

另一方面，支持使用个体接种的主要观点是，混合接种物中不同功能细菌群的混合可能干扰每个供体个体中建立的重要交叉互生和营养链，从而可能导致结果不同于个体接种。

pH值

结肠pH对肠道微生物群的组成和代谢活性有着深远的影响。重要的是，pH能影响益生元发酵关键酶的活性。Palframan等人证明了在不同pH条件下双歧杆菌对低聚果糖（FOS）、菊糖、异麦芽低聚糖（IMO）、GOS和乳果糖的作用不同。这支持了益生元组合的构想，使益生元在在结肠的不同部位起作用。在受控和不受控制的pH周期下，固定化婴儿粪便细菌的连续发酵证明了大多数细菌群体，特别是双歧杆菌属种对pH值的变化的高度敏感性。在使用了接种成人粪便微生物群体的单级发酵系统的研究中，将pH从6.5降低至5.5促进了丁酸盐的产生，增加了产丁酸盐细菌的水平，并且抑制了类杆菌属种的生长。一项研究利用接种来自四名成年供体的粪便浆液的分批培养物，研究pH值（5.2、5.9和6.4）对乳酸盐产生和利用的影响，结果表明，pH 5.2诱导乳酸盐积聚，这是由于乳酸盐利用率降低。Zihler Berner等人使用接种了3名儿童（6、8和10岁）的肠道菌群的连续PolyFermS肠模型，研究pH的影响。该研究表明，pH值从5.7降至5.5导致丁酸酯产量增加、乙酸浓度降低以及总代谢活性降低。0.2个单位的pH下降也导致了拟杆菌属成员的相对丰度降低，产丁酸盐菌的相对丰度增加。最近的一项研究表明，pH对来自不同分类细菌之间的竞争有很大的影响，这些细菌有利用相同多糖的能力，在菊糖作为唯一碳水化合物的反应器中，拟杆菌属16S rRNA基因拷贝的百分比从pH 6.9的60％降至的pH 5.5的30％。

滞留时间

滞留时间在肠道菌群的发酵过程中起着重要作用。使用三阶段连续模型（Reading模型）在体外研究滞留时间的影响。该研究表明，与60小时相比，将滞留时间降低至20小时导致乙酸酯增加和丁酸酯产量降低。重要的细菌群如瘤胃球菌属和产丁酸的罗氏弧菌在20小时的滞留时间完全从系统中移除，这表明它们的生长不够迅速以保持在生态系统中。滞留时间不仅影响碳水化合物的发酵，对于肠道细菌对蛋白质的降解也可能是重要的，来自三阶段连续模型的数据表明，酶活性、蛋白质浓度、氨和苯酚产量与滞留时间同步增加。通过使用相同的肠道模型，MacFarlane等人发现，将滞留时间从27.1小时改变为66.7小时可增加蛋白质降解和氨基酸发酵。在最近的一项研究中，将滞留时间从正常48小时改为96小时，导致生物量和总细菌数量减少。此外，在该模型系统中，延长的滞保留时间降低了横向和远端隔室的肠道微生物群多样性，同时导致近端结肠中碳水化合物发酵增加为主的代谢转变。

在最近的一篇综述中还详细讨论了体外人类肠道模型中涉及的其他参数，如氧化还原电位和厌氧生物学，本文不包括这些参数的讨论。

▌体外分批发酵模型

强调每个体外模型具有的特定优点和/或缺点是很重要的。体外模型的选择取决于实验的目的（图1，请参见原文）。我们在下文讨论不同模型的优点、缺点和技术问题，并关注在益生元和益生菌研究中最常应用的模型的最新进展。

分批发酵是测试特定菌株或粪便微生物群落代谢不同底物能力的最简单和最常用的模型。这些模型在封闭系统中接种纯培养物或粪便原料悬浮液，在控制或不控制pH下操作，并且没有额外的营养物供应。分批培养的优点是它们快速，便宜，易于操作和可重复。高通量和可自动化的特性使其成为初步调查益生菌和膳食化合物对肠道微生物群组成和代谢活动调节的有价值的方法。此外，由于能够缩减比例，这些分批发酵模型可以使所需介质体积和测试化合物最小化。在一项研究通过不同模型研究抗性淀粉作用的研究中，与TIM-2模型相比，分批发酵的SCFA比率更接近于猝死受害者测量值。分批发酵的缺点是由于底物的快速消耗、微生物代谢产物的积累和pH值的降低（可抑制微生物活性），可操作时间很短。这种短期发酵可能不支持一个营养链（一个菌种的发酵产物成为另一个菌种的底物）建立。

表1（请参见原文）总结了在分批发酵模型中观察益生菌、益生元和合生元对人肠道菌群的作用的体外研究。分批发酵研究证明了GOS、IMO、支链FOS、蜂蜜低聚糖、葡萄糖低聚糖、小麦阿糖基木聚糖、长双歧杆菌和动物双歧杆菌产生的胞外多糖、乳果糖寡糖（OsLu）、反式低聚半乳糖（B-GOS）和菊粉的益生元作用。几项研究显示合生元有抑制大肠杆菌水平，并增强益生元效应的潜力。相同的实验设置是研究pH和益生元剂量对双歧杆菌效应的影响或不同结构，分子量和聚合度益生元的作用的理想条件。有趣的是，补充益生元可以改善分批发酵模型中抗生素的作用，至少部分模拟了人类的情况。最近进行了体外抑制试验的研究表明，鼠李糖乳杆菌GG、罗伊氏乳杆菌1063、菊粉和GOS减少了粘附侵袭性大肠杆菌的存活和生长。因此，分批发酵为筛选益生菌和益生元抑制传染性和胃肠疾病中潜在病原体的能力提供了机会。

▌体外连续发酵模型

Reading模型

最早的连续发酵模型之一是Gibson、Cummings和MacFarlane开发的三阶段系统。这一多阶段系统的基本原理是大肠/结肠是由三个具有独特的pH和发酵活性的区域组成，即近端结肠、横结肠和远端结肠。因此，多隔室系统优化了结肠不同区域的特定条件下微生物群的生长。在该模型中，将无菌培养基加入代表近端结肠（pH5.5）的容器1中，并顺序加入容器2和3中，分别模拟横结肠（pH 6.2）和远端结肠（pH 6.8）。使用2M NaOH通过外部pH控制器控制pH。该模型通过对猝死受害者的结肠内容物进行测量来验证。该作者还配制了广泛应用于此后开发的其他发酵系统（如PolyFermS模型）的发酵培养基。当细菌处于稳态条件下时，通过在发酵罐中放置粘蛋白凝胶，MacFarlane等人观察到粪便微生物群迅速定植在粘蛋白凝胶上，表明该模型适合模拟肠内腔及粘膜层内侧条件下的细菌生长。将该模型用于调查小麦糊精对肠道菌群的影响，每天两次给予7g小麦糊精18天后，产丁酸盐关键细菌显着增加并在所有容器中产生明显的致丁作用。最近，三阶段发酵系统证明了含有Bimuno（一种GOS混合物（B-GOS））的橙汁的有益作用，它增加了双歧杆菌和乳杆菌数量，增加了产丁酸酯的Roseburia亚群和丁酸的产生。该模型最近还应用于调查益生元（B-GOS）对自闭症和非自闭症儿童粪便细菌种群和代谢活动的影响。该研究有了令人鼓舞的结果，B-GOS施用显着增加含有自闭症和非自闭症样品的所有容器中的双歧杆菌水平，以及非自闭症模型的远端结肠乳酸杆菌水平。

PolyFermS模型

由于冲洗掉了竞争力较小的细菌，反应器中接种粪便混悬液与接种结肠内容物相比细菌细胞密度降低。此外，自由漂浮的细菌细胞系统并不代表在结肠中的浮游和静止状态。为了克服这个缺点，人们开发了一种带有固定化粪便微生物群的发酵模型（PolyFermS），新鲜的粪便微生物群被收集在凝胶珠中，并在从外围层释放细菌进入发酵培养基之前倍增达到高密度。这种新方法在长达80天的运行时间内显着改善了体系的细菌密度，增加了系统的稳定性。此外，一个新的模型设计被开发和验证，使人们能在单个实验中，在分离的有相同微生物群组合物的平行连接的反应器中进行几种处理的测试，从而提供足够的治疗重复以及治疗与对照的比较。然而，这种模式的主要局限性在于缺乏透析和缺乏宿主反应。而且，这样的系统需要专有技术和使用昂贵的设备，因此这一种低产量的方法。

具有固定化细胞的单级和三级连续发酵系统成功证明了FOS、低聚果糖和菊粉的益生元效应（表2，请参见原文）。另一方面，在来自鼠李糖乳杆菌的EPS中没有观察到益生元作用。

SHIME，TWIN SHIME，M-SHIME

在连续发酵模型中，“人类肠道微生物生态系统模拟器”（SHIME）模型是模拟完整肠道的少数模型之一。其发展于Reading模型，SHIME与原始模型不同的是，通过整合上消化道条件，形成五个连续的隔室模拟胃和十二指肠、小肠（空肠和回肠）、升结肠、横结肠和降结肠。一个重要的技术方面是系统的稳定性，可以在2-3周后达到。表2（请参见原文）总结了大多数使用SHIME模型探讨益生菌和益生元对肠道微生物群组成和代谢活性的影响的研究。

SHIME模型设计进一步改进以适应不同的实验目的，包括Twin-SHIME、Triple-SHIME和M-SHIME模型。Twin-SHIME由两个相同的SHIME单元（每个单元包括上述五个隔室）组成，Triple-SHIME模拟三个胃和小肠隔室，为三种组合的近端和远端的结肠容器提供原料。这些模型使人们能在相同环境条件下对相同的肠道微生物群进行平行对照试验和两种处理。此外，可将不同供体的粪便微生物群接种到不同的反应器来通过这些系统研究个体间差异的影响。Grootaert等人使用Twin-SHIME比较阿糖基木聚糖低聚糖（AXOS）和菊糖的益生元效应，该研究表明，两种寡糖的降解和SCFA产生具有结肠室特异性，近端结肠和横结肠分别是菊粉和AXOS降解的主要位点。Twin-SHIME用于证明SHIME模型的可重复性，并进一步揭示了微生物群落的结肠区域特异性，其中分解糖和降解粘蛋白的细菌分别存在于近端和远端区域中。Twin-SHIME的另一项研究表明，金合欢树胶对FOS和菊糖的部分替代增加了丙酸盐和丁酸盐，并显示出双歧杆菌效应。最近使用接种来自IBD患者的粪便样品的Triple-SHIME模型的研究通过IL-8浓度降低和IL-10量增加揭示了对FOS和阿拉伯半乳聚糖（AG）的结肠区域特异性抗炎反应。

为了更精确地模拟覆盖有保护性粘液层的人体肠道，SHIME通过添加粘蛋白覆盖的微生态系统（其每日替换以模拟粘液层的更新）合成粘膜环境。这种被称为粘膜-SIME（M-SHIME）的模型不仅可以模拟悬浮的肠道微生物，而且还能模拟附着于表面的肠道微生物和粘蛋白降解群落，例如，被认为是下一代益生菌的柔嫩梭菌群和嗜粘蛋白-艾克曼菌。然而，主要在远端结肠中降解粘蛋白的粘液霉菌在M-SHIME中未达到高密度，这表明M-SHIME模型可通过模拟远端结肠进一步完善。此外，具有强烈粘附性的鼠李糖乳杆菌GG（LGG）选择性的定植于粘膜区域，表明该模型可以预防粘附微生物的冲刷。该模型有助于研究促使肠道微生物群定位在与宿主上皮细胞密切相互作用的粘膜区域的因素。最近使用M-SHIME的研究显示路氏乳杆菌1063、长链阿糖基木聚糖和GOS抑制粘液中的粘附侵袭性大肠杆菌，表明益生菌和益生元可能会限制机会病原体通过接近上皮细胞对宿主产生不利影响。最近还开发了其他的吸收单元来模拟小肠吸收过程。与其他发酵模型一样，SHIME具有一定的局限性，包括使用比新鲜制备的胃粘蛋白具有更低摩尔质量和更多杂质的猪胃粘蛋白，并且缺乏体内从血液释放到粘液层的氧气梯度。后者及宿主反应的缺乏可以通过将SHIME与宿主微生物相互作用（HMI）模块耦合来克服。由上部粘液层和下部半透膜组成的HMI模块将含有肠上皮细胞系的下部隔室与含有SHIME流出物的腔室隔开。这种设计允许在剪切力和微需氧条件下研究细菌粘附。此外，它可以使氧气和代谢物穿过隔室并且使细胞直接接触复杂的微生物群。对低成本、低通量以及对训练有素的操作员的需求进一步阻碍了SHIME的应用。

TIM-2

基于模拟胃到小肠的TIM-1系统，1999年开发了TNO体外结肠模型（TIM-2），其有两个独特之处，即蠕动混合和模拟摄取代谢产物的透析膜。先前的研究表明，在稳态条件下操作的系统中，稀释度，底物限制和产物抑制是限制最佳细菌生长的主要因素。因此，TIM-2被设计成可模拟肠道上皮对微生物代谢产物的摄取，其积累可能导致细菌代谢和生长的抑制。然而，致密且粘稠的浓缩饲料导致混合困难，这可以通过柔性膜的蠕动运动解决。使用相同的粪便接种物可以平行运行多达10个TIM-2单元，从而可以在对照和不同处理之间进行比较。该系统用于以10 g/d的浓度研究乳果糖、菊糖、低聚半乳糖的作用。有趣的是，使用TIM-2接种来自瘦和肥胖受试者的粪便样品的研究表明，瘦和肥胖微生物对低聚半乳糖、乳果糖、苹果纤维和甜菜果胶的发酵不同。同样，在用猪粪便接种的TIM-2中GOS的降解比接种人粪便时更明显，这突出表明在益生元和益生菌干预研究中从动物数据到人类的转换应该谨慎地进行。当抗生素和益生菌同时应用于TIM-2时，导致双歧杆菌和乳酸菌数量增加。

▌讨论

在广泛应用于检验益生元、益生菌或环境调节剂的效果之前，需通过与体外数据和从人受试者获得的数据相比较来验证体外模型。通过使用从四名猝死受害者中获得的近端和远端结肠肠腔内容物验证了三阶段连续发酵系统（Reading模型），显示出与体外数据相当的细菌种群和代谢活性。TIM-2模型也通过显示高细菌密度进行了验证，接近体内结肠的细菌密度。使用从三个供体获得的粪便微生物群独立发酵的数据验证了PolyFermS模型培养类似于粪便供体的复杂肠道微生物群的能力。类似地，通过显示阿拉伯半乳聚糖、木聚糖和果胶的发酵模式在体外和体内之间可比较数据验证了SHIME模型。

有趣的是，通过使用TIM-2检测到瘦和肥胖粪便微生物群对GOS、乳果糖、苹果纤维和甜菜果胶的不同发酵模式。类似地，在分批发酵模型中，肥胖和正常体重组之间显示对谷物膳食纤维不同的细菌代谢，其中肥胖的微生物群导致丙酸盐和丁酸盐产生增加。这些结果部分反映了体内的情况，在肥胖儿童中检测到丙酸盐和丁酸盐的水平显著升高。

需注意，包括近端结肠，横结肠和远端结肠容器的多阶段连续模型仅仅是体内情况的简化模型，其中由于底物供应的限制，在远端结肠内，肠道微生物群在间歇或分批补料的条件下生长。为了更真实地模拟体外肠道环境，必须规划微生物群适应实验条件的时期。因此，另一个技术问题是稳定期，它是关键的，并且在不同的模型中有所不同，从16小时到3周不等（表3，请参见原文）。这段时间对于粪便微生物群适应发酵条件以及在引入实验处理时建立稳定的微生物群组成和代谢活性是重要的。事实上，膳食纤维摄入量的变化可能需要几个月才能在人体内稳定。

应根据研究的目的选择合适的模型，因为每种发酵方法都具有特定的优势（图1，表3，请参见原文）。分批发酵的快速、高通量和自动化特性使其适用于筛选不同剂量和组合的新膳食化合物。分批发酵的主要缺点是发酵时间短，代谢产物积累和pH降低，从而抑制微生物活性。另一方面，连续培养允许长期发酵并且更接近地模拟体内条件。包括Reading模型，PolyFermS和SHIME在内的多隔室系统能够模拟结肠的特定区域（即近端，横向和远端结肠）。PolyFermS仍是使用固定技术将细菌固定到凝胶珠上的唯一模型，因此可以将发酵延长至几个月，同时保持稳定的细菌组成和代谢活性。通过在发酵罐中放置粘蛋白凝胶及添加粘蛋白覆盖的微生态系统，Reading和SHIME模型分别可以更准确地模拟人类肠道的厚粘液层的内侧。选择发酵模型时要考虑的另一个重要特征是比较不同剂量的益生元和益生菌治疗或有阴性/阳性对照的能力。这可以在单级模型如TIM-2和PolyFermS中完成，或者多级模型如Twin-SHIME 和Triple-SHIME中完成。与其他模型相比，TIM-2具有独特的蠕动混合和透析系统，可以达到生理代谢物浓度。

上述体外发酵模型的一个普遍限制是缺乏宿主反应。这可以通过将发酵模型与人类细胞模型相结合来部分克服，将发酵流出物添加至上皮单层如Caco-2或分泌粘液的HT29-MTX。一个例子是上述的SHIME-HMI模块。其他微生物- 宿主相互作用模型包括Transwell共培养模型、Human Oxygen Bacteria ANaerobic模型（HoxBan）、Gut-on-a-chip模型、具有跨上皮电阻测量的Organs-on-chips模型和human-microbial crosstalk(HuMix)模型。主要挑战包括重复性和功能稳定性，这在之前的回顾中有详细讨论。此外，肠道微生物群个体间的巨大的变异性也对生物学重复构成巨大挑战。这可以部分地通过在不同的发酵系统中使用多个供体或通过汇集来自不同供体的粪便样品来克服。虽然前者对于需要长时间稳定期的系统来说费时费力，但后者正在像前面讨论的那样具有强烈的争议。

对传统的三阶段系统进行扩展，Mäkivuokko和Nurminen设计了EnteroMix®，其包含四个容器，分别代表升结肠、横结肠、降结肠和降结肠末端，具有相应的pH和滞留时间。在多级连续模型中，EnteroMix容器的工作容积最小，因此可以模拟有限数量的测试底物。最近，正在开发其他发酵模型，包括粪便微型反应器阵列（MBRAs）、胃肠道模拟器（SIMGI）和填充柱生物膜反应器。先前的文章对每种方法的特点和潜力进行了广泛的介绍。这些系统在益生元和益生菌的筛选和开发中的应用是有限的，因此本文将不讨论这些系统。新模型的发展对克服当前模型的局限性非常重要。然而，比较使用不同的培养时间、粪便接种物组成、底物浓度、培养基组成、稳定期的持续时间和分析程序的不同模型获得的发酵模式是具有挑战性的。因此，体外肠发酵过程的标准化将有助于比较益生菌和益生元对肠道微生物群组成和代谢活性的影响。

总之，体外肠道发酵仍然是筛选以及研究益生元和益生菌作用机制的不可替代的工具。研究的目标决定我们选择哪种模型系统。在选择合适的模型时，应考虑每个模型的技术问题、优点和局限性，因为它们是每个模型的能力的决定性因素。

-THE END-

不一样的消化科