益生菌 第214页

V.T. Pham and M.H. Mohajeri. The application of in vitro human intestinal models on the screening and development of pre- and probiotics. Benef Microbes. 2018 Apr 26:1-18.

▌介绍

人体内有大量的微生物，其中胃肠道是迄今为止最大的定植器官，其包含的不同节段具有不同环境条件和微生物谱，这反映在细菌细胞的分布不均，胃和十二指肠细菌浓度低（每克10^1至10^3个细菌），在空肠和回肠中增加至每克10^4至10^7个细菌，结肠中浓度最高（每克10^11至10^12个细菌）。结肠含有人体中所有微生物的70％以上。消化物质的缓慢流动为细菌提供了发酵来源于饮食和内源性分泌物的未消化的底物以增殖的时间，因此，人类肠道是一个大型、多样化和动态的细菌群落的自然栖息地，迄今为止描述的细菌种类超过1,200种。最近的分析表明，我们体内的细菌数量与人类细胞总数相同，并且含有比人类基因组多100倍的基因。需注意受年龄、性别、饮食、疾病、药物和环境等影响，个体之间的微生物组成存在显着差异。人们早已认识到并记录了这个庞大而动态的细菌群落对宿主健康和疾病的意义及影响。在早年生活中，肠道菌群的定植及代谢与胃肠疾病的病因相关，如婴儿腹痛和坏死性小肠结肠炎。人类肠道微生物群在免疫系统的发育和稳态中发挥着重要作用，并可能与多系统器官衰竭、结肠直肠癌、炎症性肠病（IBD）和肥胖等特定病理状况有关。此外，肠道微生物群与神经系统之间的关系也日益显著。因此，人们有机会通过开发益生菌和益生元干预来调节肠道微生物以获得长期持久的健康。

益生菌被定义为“一种活的微生物，在给予足够剂量时，对宿主健康有益”。益生菌发挥其有益作用的机制包括改变肠道微生物群、竞争并限制病原体的定植、增强上皮屏障功能和调节免疫系统。益生元最初定义为“不易消化的食物成分，通过选择性刺激结肠中一种或少数几种细菌的生长和/或活性对宿主产生有益影响，改善宿主健康”。经过20年的研究，益生元的概念已获得发展，定义已被多次完善。益生元的最新定义是“宿主微生物选择性利用的底物，赋予宿主健康益处”。一些关键性的研究总结了益生元和益生菌在总体健康、结直肠癌、IBD和肥胖中的作用。在这篇综述中，我们讨论了体外肠道模型是作为益生元和益生菌研究的有用方法及最常用模型的优缺点和技术问题。此外，我们对应用这些模型进行益生元和益生菌研究的文献进行了总结。

▌体外人类肠道模型是益生元和益生菌发展的有力工具

在益生元和益生菌的研究中，体外和体内研究之间的整合是必要的，可以互相补充。下面将讨论每种方法的优点和缺点。

人体研究

人体研究可利用粪便样品，它能初步反应胃肠道微生物组成。这种类型的研究还能够建立微生物群组成与宿主表型或环境之间的相关性，产生研究问题，或者可以用来确认在简化模型中观察到的效应或机制。

营养化合物对肠道微生物群的影响可以通过给予人类受试者过量的测试成分来证明，但可能导致不良反应。因此，介于道德及安全问题，这些研究往往受到限制。而且，很难监测和严格遵守介入治疗。新的数据也提供了结肠微生物群能快速适应底物可用性改变的证据。在人体研究中，取样大多限于粪便探针作为终点测量。由于侵入性和不方便操作，从胃肠道不同区域（例如近端结肠）获取样品受到限制，因此难以准确确定起效的部位，及进一步确定益生元和益生菌的作用机制。肠道上皮细胞分泌形成粘液层，将肠腔和宿主组织分开。然而，粘液层的采样是侵入性的，粪便样品的使用无法代表粘膜群落。在人体研究中，由于宿主-微生物群之间不可避免的相互作用，益生元和益生菌对肠道微生物活性的直接影响通常难以解释。人体研究的另一个挑战是由遗传背景、饮食、健康状况、生活方式和环境条件等混杂因素引起的巨大的个体差异。最后，难以确定益生元和益生菌对肠道微生物群组成的影响是通过直接刺激生长或是通过微生物群短链脂肪酸（SCFA）（可降低pH）的产生。 

动物研究

动物模型（主要是小鼠、大鼠和小猪）使我们可以在高度控制的环境下调节和研究宿主- 微生物相互作用，从而将人体研究中常见的混杂因素的影响降至最低。其中无菌动物是研究肠道微生物对宿主功能影响的最适合的模型。处死动物后我们可以直接获取结肠内容物，结肠内容物中的细菌代谢物例如SCFA还没有被宿主吸收，因此与使用粪便的研究相比，动物试验更适合于研究肠道微生物群的代谢活性。

最近一项使用新生仔猪模型的研究证明了低聚半乳糖（GOS）对肠道功能的影响，如促进肠道微生物群平衡，改善肠道组织形态和刺激肠道免疫系统。一般而言，动物模型在营养干预例如肠胃外营养、低聚糖、益生元和益生菌的筛选方面具有优势，并能进一步阐明其作用机制和对宿主的影响，鉴定微生物和宿主生物标志物，这些在非侵入性婴儿研究是不可能做到的。然而，动物模型是昂贵的，劳动密集的，并且在生理学上可能不能代表人体代谢。另外，动物的微生物组不同于人类的微生物组，因此，将从动物模型获得的发现转用于人类仍然是一个挑战。

体外肠道发酵模型

为了克服体内研究的这些缺点，人们开发了体外发酵模型，作为在高度控制的条件下研究人类肠道微生物群的有力工具，它使我们能够在模拟不同结肠区域的反应器中随时间动态取样。

与体内研究相比，体外结肠发酵模型更便宜，可重复性更高，不需要经过精心准备伦理批准，并且可以在更短的时间内进行研究。这些模型能够在模拟的生理条件下培养来自粪便样品的人类肠道微生物群。几种模型还可以进一步模拟酶消化活性、粘液生成以及微生物群和宿主之间的相互作用。因此，研究人员能够使用这些系统来研究益生元和益生菌对肠道微生物群的影响、益生元的发酵谱、益生菌在整个胃肠道的生存能力和功能。体外发酵模型不仅可用于筛选和开发不同的益生元及益生菌，还能用于机制研究，并在碳水化合物和蛋白质发酵、类固醇和胆汁酸代谢、氢气形成和清除领域形成假设。

体外发酵的原理是在生理条件下（厌氧生活、保留时间、培养基、温度和pH）将粪便微生物群接种在营养培养基中。最简单的模型是分批发酵，由于底物的快速消耗和pH的降低（抑制微生物活性），适用于短期实验。另一方面，具有不同复杂程度的连续培养可允许长期发酵和参数调整以模拟体内条件。单阶段模型通常模拟近端结肠的条件，而多阶段发酵模型可以模拟结肠的不同区域（近端结肠、横结肠和远端结肠）。

考虑到每种方法的优点和局限性，将体外和动物模型与人体研究相结合设计多尺度的策略可能有助于深入了解肠道微生物群，饮食和宿主之间的复杂关系;并进一步阐明肠道微生物群在健康和疾病中的作用。

▌体外人类肠道模型的重要参数

粪便接种

胃肠道不同区域具有不同环境条件和微生物特征。因此，模拟一个区域（例如近端结肠）的模型最好应接种该特定区域的生物学内容物。然而，收集此类样品需要侵入性的操作，导致了伦理的约束，因此大多数体外结肠发酵模型接种的是粪便样品。尽管如此，理论上通过选择专门的发酵培养基，仍然可以模拟胃肠道中所需区域的条件。需注意，使用粪便样品可能会将额外的未定义的底物引入系统中。为了减少底物污染物的影响，粪便样品经常短暂离心以去除大颗粒。此外，在确定的发酵培养基中分批发酵粪便接种物将进一步促进粪便微生物群适应特定结肠区域的实验条件。

考虑到由性别、饮食、地理位置、种族和年龄引起的粪便供体者之间的个体间差异，来自不同供体的粪便样品在接种到体外系统之前是否应该汇集仍然存在争议。有利于汇集微生物群的争论是汇集可以限制个体间变异性并提供可以重复用于不同发酵的标准化微生物群，便于实验之间的比较。值得注意的是，随着时间的推移，除个体差异之外，同一个供体内的差异也可能导致不同的微生物群组成和代谢活性。此外，汇集粪便样品会增加总体多样性并导致更广泛的肠道微生物谱。最近一项使用TIM-2系统的研究比较了来自单个供体和四个供体的肠道微生物群的稳定性和活性。作者强调了单个供体在多样性和功能方面与多个供体相似，这表明粪便样品的汇集适合用于发酵实验。

另一方面，支持使用个体接种的主要观点是，混合接种物中不同功能细菌群的混合可能干扰每个供体个体中建立的重要交叉互生和营养链，从而可能导致结果不同于个体接种。

pH值

结肠pH对肠道微生物群的组成和代谢活性有着深远的影响。重要的是，pH能影响益生元发酵关键酶的活性。Palframan等人证明了在不同pH条件下双歧杆菌对低聚果糖（FOS）、菊糖、异麦芽低聚糖（IMO）、GOS和乳果糖的作用不同。这支持了益生元组合的构想，使益生元在在结肠的不同部位起作用。在受控和不受控制的pH周期下，固定化婴儿粪便细菌的连续发酵证明了大多数细菌群体，特别是双歧杆菌属种对pH值的变化的高度敏感性。在使用了接种成人粪便微生物群体的单级发酵系统的研究中，将pH从6.5降低至5.5促进了丁酸盐的产生，增加了产丁酸盐细菌的水平，并且抑制了类杆菌属种的生长。一项研究利用接种来自四名成年供体的粪便浆液的分批培养物，研究pH值（5.2、5.9和6.4）对乳酸盐产生和利用的影响，结果表明，pH 5.2诱导乳酸盐积聚，这是由于乳酸盐利用率降低。Zihler Berner等人使用接种了3名儿童（6、8和10岁）的肠道菌群的连续PolyFermS肠模型，研究pH的影响。该研究表明，pH值从5.7降至5.5导致丁酸酯产量增加、乙酸浓度降低以及总代谢活性降低。0.2个单位的pH下降也导致了拟杆菌属成员的相对丰度降低，产丁酸盐菌的相对丰度增加。最近的一项研究表明，pH对来自不同分类细菌之间的竞争有很大的影响，这些细菌有利用相同多糖的能力，在菊糖作为唯一碳水化合物的反应器中，拟杆菌属16S rRNA基因拷贝的百分比从pH 6.9的60％降至的pH 5.5的30％。

滞留时间

滞留时间在肠道菌群的发酵过程中起着重要作用。使用三阶段连续模型（Reading模型）在体外研究滞留时间的影响。该研究表明，与60小时相比，将滞留时间降低至20小时导致乙酸酯增加和丁酸酯产量降低。重要的细菌群如瘤胃球菌属和产丁酸的罗氏弧菌在20小时的滞留时间完全从系统中移除，这表明它们的生长不够迅速以保持在生态系统中。滞留时间不仅影响碳水化合物的发酵，对于肠道细菌对蛋白质的降解也可能是重要的，来自三阶段连续模型的数据表明，酶活性、蛋白质浓度、氨和苯酚产量与滞留时间同步增加。通过使用相同的肠道模型，MacFarlane等人发现，将滞留时间从27.1小时改变为66.7小时可增加蛋白质降解和氨基酸发酵。在最近的一项研究中，将滞留时间从正常48小时改为96小时，导致生物量和总细菌数量减少。此外，在该模型系统中，延长的滞保留时间降低了横向和远端隔室的肠道微生物群多样性，同时导致近端结肠中碳水化合物发酵增加为主的代谢转变。

在最近的一篇综述中还详细讨论了体外人类肠道模型中涉及的其他参数，如氧化还原电位和厌氧生物学，本文不包括这些参数的讨论。

▌体外分批发酵模型

强调每个体外模型具有的特定优点和/或缺点是很重要的。体外模型的选择取决于实验的目的（图1，请参见原文）。我们在下文讨论不同模型的优点、缺点和技术问题，并关注在益生元和益生菌研究中最常应用的模型的最新进展。

分批发酵是测试特定菌株或粪便微生物群落代谢不同底物能力的最简单和最常用的模型。这些模型在封闭系统中接种纯培养物或粪便原料悬浮液，在控制或不控制pH下操作，并且没有额外的营养物供应。分批培养的优点是它们快速，便宜，易于操作和可重复。高通量和可自动化的特性使其成为初步调查益生菌和膳食化合物对肠道微生物群组成和代谢活动调节的有价值的方法。此外，由于能够缩减比例，这些分批发酵模型可以使所需介质体积和测试化合物最小化。在一项研究通过不同模型研究抗性淀粉作用的研究中，与TIM-2模型相比，分批发酵的SCFA比率更接近于猝死受害者测量值。分批发酵的缺点是由于底物的快速消耗、微生物代谢产物的积累和pH值的降低（可抑制微生物活性），可操作时间很短。这种短期发酵可能不支持一个营养链（一个菌种的发酵产物成为另一个菌种的底物）建立。

表1（请参见原文）总结了在分批发酵模型中观察益生菌、益生元和合生元对人肠道菌群的作用的体外研究。分批发酵研究证明了GOS、IMO、支链FOS、蜂蜜低聚糖、葡萄糖低聚糖、小麦阿糖基木聚糖、长双歧杆菌和动物双歧杆菌产生的胞外多糖、乳果糖寡糖（OsLu）、反式低聚半乳糖（B-GOS）和菊粉的益生元作用。几项研究显示合生元有抑制大肠杆菌水平，并增强益生元效应的潜力。相同的实验设置是研究pH和益生元剂量对双歧杆菌效应的影响或不同结构，分子量和聚合度益生元的作用的理想条件。有趣的是，补充益生元可以改善分批发酵模型中抗生素的作用，至少部分模拟了人类的情况。最近进行了体外抑制试验的研究表明，鼠李糖乳杆菌GG、罗伊氏乳杆菌1063、菊粉和GOS减少了粘附侵袭性大肠杆菌的存活和生长。因此，分批发酵为筛选益生菌和益生元抑制传染性和胃肠疾病中潜在病原体的能力提供了机会。

▌体外连续发酵模型

Reading模型

最早的连续发酵模型之一是Gibson、Cummings和MacFarlane开发的三阶段系统。这一多阶段系统的基本原理是大肠/结肠是由三个具有独特的pH和发酵活性的区域组成，即近端结肠、横结肠和远端结肠。因此，多隔室系统优化了结肠不同区域的特定条件下微生物群的生长。在该模型中，将无菌培养基加入代表近端结肠（pH5.5）的容器1中，并顺序加入容器2和3中，分别模拟横结肠（pH 6.2）和远端结肠（pH 6.8）。使用2M NaOH通过外部pH控制器控制pH。该模型通过对猝死受害者的结肠内容物进行测量来验证。该作者还配制了广泛应用于此后开发的其他发酵系统（如PolyFermS模型）的发酵培养基。当细菌处于稳态条件下时，通过在发酵罐中放置粘蛋白凝胶，MacFarlane等人观察到粪便微生物群迅速定植在粘蛋白凝胶上，表明该模型适合模拟肠内腔及粘膜层内侧条件下的细菌生长。将该模型用于调查小麦糊精对肠道菌群的影响，每天两次给予7g小麦糊精18天后，产丁酸盐关键细菌显着增加并在所有容器中产生明显的致丁作用。最近，三阶段发酵系统证明了含有Bimuno（一种GOS混合物（B-GOS））的橙汁的有益作用，它增加了双歧杆菌和乳杆菌数量，增加了产丁酸酯的Roseburia亚群和丁酸的产生。该模型最近还应用于调查益生元（B-GOS）对自闭症和非自闭症儿童粪便细菌种群和代谢活动的影响。该研究有了令人鼓舞的结果，B-GOS施用显着增加含有自闭症和非自闭症样品的所有容器中的双歧杆菌水平，以及非自闭症模型的远端结肠乳酸杆菌水平。

PolyFermS模型

由于冲洗掉了竞争力较小的细菌，反应器中接种粪便混悬液与接种结肠内容物相比细菌细胞密度降低。此外，自由漂浮的细菌细胞系统并不代表在结肠中的浮游和静止状态。为了克服这个缺点，人们开发了一种带有固定化粪便微生物群的发酵模型（PolyFermS），新鲜的粪便微生物群被收集在凝胶珠中，并在从外围层释放细菌进入发酵培养基之前倍增达到高密度。这种新方法在长达80天的运行时间内显着改善了体系的细菌密度，增加了系统的稳定性。此外，一个新的模型设计被开发和验证，使人们能在单个实验中，在分离的有相同微生物群组合物的平行连接的反应器中进行几种处理的测试，从而提供足够的治疗重复以及治疗与对照的比较。然而，这种模式的主要局限性在于缺乏透析和缺乏宿主反应。而且，这样的系统需要专有技术和使用昂贵的设备，因此这一种低产量的方法。

具有固定化细胞的单级和三级连续发酵系统成功证明了FOS、低聚果糖和菊粉的益生元效应（表2，请参见原文）。另一方面，在来自鼠李糖乳杆菌的EPS中没有观察到益生元作用。

SHIME，TWIN SHIME，M-SHIME

在连续发酵模型中，“人类肠道微生物生态系统模拟器”（SHIME）模型是模拟完整肠道的少数模型之一。其发展于Reading模型，SHIME与原始模型不同的是，通过整合上消化道条件，形成五个连续的隔室模拟胃和十二指肠、小肠（空肠和回肠）、升结肠、横结肠和降结肠。一个重要的技术方面是系统的稳定性，可以在2-3周后达到。表2（请参见原文）总结了大多数使用SHIME模型探讨益生菌和益生元对肠道微生物群组成和代谢活性的影响的研究。

SHIME模型设计进一步改进以适应不同的实验目的，包括Twin-SHIME、Triple-SHIME和M-SHIME模型。Twin-SHIME由两个相同的SHIME单元（每个单元包括上述五个隔室）组成，Triple-SHIME模拟三个胃和小肠隔室，为三种组合的近端和远端的结肠容器提供原料。这些模型使人们能在相同环境条件下对相同的肠道微生物群进行平行对照试验和两种处理。此外，可将不同供体的粪便微生物群接种到不同的反应器来通过这些系统研究个体间差异的影响。Grootaert等人使用Twin-SHIME比较阿糖基木聚糖低聚糖（AXOS）和菊糖的益生元效应，该研究表明，两种寡糖的降解和SCFA产生具有结肠室特异性，近端结肠和横结肠分别是菊粉和AXOS降解的主要位点。Twin-SHIME用于证明SHIME模型的可重复性，并进一步揭示了微生物群落的结肠区域特异性，其中分解糖和降解粘蛋白的细菌分别存在于近端和远端区域中。Twin-SHIME的另一项研究表明，金合欢树胶对FOS和菊糖的部分替代增加了丙酸盐和丁酸盐，并显示出双歧杆菌效应。最近使用接种来自IBD患者的粪便样品的Triple-SHIME模型的研究通过IL-8浓度降低和IL-10量增加揭示了对FOS和阿拉伯半乳聚糖（AG）的结肠区域特异性抗炎反应。

为了更精确地模拟覆盖有保护性粘液层的人体肠道，SHIME通过添加粘蛋白覆盖的微生态系统（其每日替换以模拟粘液层的更新）合成粘膜环境。这种被称为粘膜-SIME（M-SHIME）的模型不仅可以模拟悬浮的肠道微生物，而且还能模拟附着于表面的肠道微生物和粘蛋白降解群落，例如，被认为是下一代益生菌的柔嫩梭菌群和嗜粘蛋白-艾克曼菌。然而，主要在远端结肠中降解粘蛋白的粘液霉菌在M-SHIME中未达到高密度，这表明M-SHIME模型可通过模拟远端结肠进一步完善。此外，具有强烈粘附性的鼠李糖乳杆菌GG（LGG）选择性的定植于粘膜区域，表明该模型可以预防粘附微生物的冲刷。该模型有助于研究促使肠道微生物群定位在与宿主上皮细胞密切相互作用的粘膜区域的因素。最近使用M-SHIME的研究显示路氏乳杆菌1063、长链阿糖基木聚糖和GOS抑制粘液中的粘附侵袭性大肠杆菌，表明益生菌和益生元可能会限制机会病原体通过接近上皮细胞对宿主产生不利影响。最近还开发了其他的吸收单元来模拟小肠吸收过程。与其他发酵模型一样，SHIME具有一定的局限性，包括使用比新鲜制备的胃粘蛋白具有更低摩尔质量和更多杂质的猪胃粘蛋白，并且缺乏体内从血液释放到粘液层的氧气梯度。后者及宿主反应的缺乏可以通过将SHIME与宿主微生物相互作用（HMI）模块耦合来克服。由上部粘液层和下部半透膜组成的HMI模块将含有肠上皮细胞系的下部隔室与含有SHIME流出物的腔室隔开。这种设计允许在剪切力和微需氧条件下研究细菌粘附。此外，它可以使氧气和代谢物穿过隔室并且使细胞直接接触复杂的微生物群。对低成本、低通量以及对训练有素的操作员的需求进一步阻碍了SHIME的应用。    

TIM-2

基于模拟胃到小肠的TIM-1系统，1999年开发了TNO体外结肠模型（TIM-2），其有两个独特之处，即蠕动混合和模拟摄取代谢产物的透析膜。先前的研究表明，在稳态条件下操作的系统中，稀释度，底物限制和产物抑制是限制最佳细菌生长的主要因素。因此，TIM-2被设计成可模拟肠道上皮对微生物代谢产物的摄取，其积累可能导致细菌代谢和生长的抑制。然而，致密且粘稠的浓缩饲料导致混合困难，这可以通过柔性膜的蠕动运动解决。使用相同的粪便接种物可以平行运行多达10个TIM-2单元，从而可以在对照和不同处理之间进行比较。该系统用于以10 g/d的浓度研究乳果糖、菊糖、低聚半乳糖的作用。有趣的是，使用TIM-2接种来自瘦和肥胖受试者的粪便样品的研究表明，瘦和肥胖微生物对低聚半乳糖、乳果糖、苹果纤维和甜菜果胶的发酵不同。同样，在用猪粪便接种的TIM-2中GOS的降解比接种人粪便时更明显，这突出表明在益生元和益生菌干预研究中从动物数据到人类的转换应该谨慎地进行。当抗生素和益生菌同时应用于TIM-2时，导致双歧杆菌和乳酸菌数量增加。

▌讨论

在广泛应用于检验益生元、益生菌或环境调节剂的效果之前，需通过与体外数据和从人受试者获得的数据相比较来验证体外模型。通过使用从四名猝死受害者中获得的近端和远端结肠肠腔内容物验证了三阶段连续发酵系统（Reading模型），显示出与体外数据相当的细菌种群和代谢活性。TIM-2模型也通过显示高细菌密度进行了验证，接近体内结肠的细菌密度。使用从三个供体获得的粪便微生物群独立发酵的数据验证了PolyFermS模型培养类似于粪便供体的复杂肠道微生物群的能力。类似地，通过显示阿拉伯半乳聚糖、木聚糖和果胶的发酵模式在体外和体内之间可比较数据验证了SHIME模型。

有趣的是，通过使用TIM-2检测到瘦和肥胖粪便微生物群对GOS、乳果糖、苹果纤维和甜菜果胶的不同发酵模式。类似地，在分批发酵模型中，肥胖和正常体重组之间显示对谷物膳食纤维不同的细菌代谢，其中肥胖的微生物群导致丙酸盐和丁酸盐产生增加。这些结果部分反映了体内的情况，在肥胖儿童中检测到丙酸盐和丁酸盐的水平显著升高。

需注意，包括近端结肠，横结肠和远端结肠容器的多阶段连续模型仅仅是体内情况的简化模型，其中由于底物供应的限制，在远端结肠内，肠道微生物群在间歇或分批补料的条件下生长。为了更真实地模拟体外肠道环境，必须规划微生物群适应实验条件的时期。因此，另一个技术问题是稳定期，它是关键的，并且在不同的模型中有所不同，从16小时到3周不等（表3，请参见原文）。这段时间对于粪便微生物群适应发酵条件以及在引入实验处理时建立稳定的微生物群组成和代谢活性是重要的。事实上，膳食纤维摄入量的变化可能需要几个月才能在人体内稳定。

应根据研究的目的选择合适的模型，因为每种发酵方法都具有特定的优势（图1，表3，请参见原文）。分批发酵的快速、高通量和自动化特性使其适用于筛选不同剂量和组合的新膳食化合物。分批发酵的主要缺点是发酵时间短，代谢产物积累和pH降低，从而抑制微生物活性。另一方面，连续培养允许长期发酵并且更接近地模拟体内条件。包括Reading模型，PolyFermS和SHIME在内的多隔室系统能够模拟结肠的特定区域（即近端，横向和远端结肠）。PolyFermS仍是使用固定技术将细菌固定到凝胶珠上的唯一模型，因此可以将发酵延长至几个月，同时保持稳定的细菌组成和代谢活性。通过在发酵罐中放置粘蛋白凝胶及添加粘蛋白覆盖的微生态系统，Reading和SHIME模型分别可以更准确地模拟人类肠道的厚粘液层的内侧。选择发酵模型时要考虑的另一个重要特征是比较不同剂量的益生元和益生菌治疗或有阴性/阳性对照的能力。这可以在单级模型如TIM-2和PolyFermS中完成，或者多级模型如Twin-SHIME 和Triple-SHIME中完成。与其他模型相比，TIM-2具有独特的蠕动混合和透析系统，可以达到生理代谢物浓度。

上述体外发酵模型的一个普遍限制是缺乏宿主反应。这可以通过将发酵模型与人类细胞模型相结合来部分克服，将发酵流出物添加至上皮单层如Caco-2或分泌粘液的HT29-MTX。一个例子是上述的SHIME-HMI模块。其他微生物- 宿主相互作用模型包括Transwell共培养模型、Human Oxygen Bacteria ANaerobic模型（HoxBan）、Gut-on-a-chip模型、具有跨上皮电阻测量的Organs-on-chips模型和human-microbial crosstalk(HuMix)模型。主要挑战包括重复性和功能稳定性，这在之前的回顾中有详细讨论。此外，肠道微生物群个体间的巨大的变异性也对生物学重复构成巨大挑战。这可以部分地通过在不同的发酵系统中使用多个供体或通过汇集来自不同供体的粪便样品来克服。虽然前者对于需要长时间稳定期的系统来说费时费力，但后者正在像前面讨论的那样具有强烈的争议。

对传统的三阶段系统进行扩展，Mäkivuokko和Nurminen设计了EnteroMix®，其包含四个容器，分别代表升结肠、横结肠、降结肠和降结肠末端，具有相应的pH和滞留时间。在多级连续模型中，EnteroMix容器的工作容积最小，因此可以模拟有限数量的测试底物。最近，正在开发其他发酵模型，包括粪便微型反应器阵列（MBRAs）、胃肠道模拟器（SIMGI）和填充柱生物膜反应器。先前的文章对每种方法的特点和潜力进行了广泛的介绍。这些系统在益生元和益生菌的筛选和开发中的应用是有限的，因此本文将不讨论这些系统。新模型的发展对克服当前模型的局限性非常重要。然而，比较使用不同的培养时间、粪便接种物组成、底物浓度、培养基组成、稳定期的持续时间和分析程序的不同模型获得的发酵模式是具有挑战性的。因此，体外肠发酵过程的标准化将有助于比较益生菌和益生元对肠道微生物群组成和代谢活性的影响。

总之，体外肠道发酵仍然是筛选以及研究益生元和益生菌作用机制的不可替代的工具。研究的目标决定我们选择哪种模型系统。在选择合适的模型时，应考虑每个模型的技术问题、优点和局限性，因为它们是每个模型的能力的决定性因素。

-THE END-

不 一 样 的 消 化 科

翻译 / 张灵

编辑 / 叶峰

2018.10.12-14 南京

欢 迎 全 国 各 地 消 化 同 仁 莅 临

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申明 / 本文系消化客编译整理，水平有限，仅供临床、科研人士学习分享交流，内容以英文原版为准。点击阅读原文，查看更多消化资讯。

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常言道，屁股决定脑袋。我们在这里可以换一个词说，肚子决定脑袋！而越来越多的研究显示肚子中的微生物具有影响脑袋的重要作用。

科学家们在这篇重量级《Cell》研究中，再次明确肠道菌群对大脑中关键免疫细胞-小胶质细胞（microglia）具有显著影响。研究还表明，随着发育的不同阶段，这样的影响因性别的不同而不一样。

相比较于正常小鼠，没有肠道微生物的小鼠在胚胎发育过程中其脑袋中的小胶质细胞密度更高，并且，这些小胶质细胞的形态呈现出更多的分叉。

▶小胶质细胞促成大脑的发育与维持

▲培养中的小胶质细胞

众所周知，小胶质细胞(microglia)是神经胶质细胞的一种，相当于外周组织中的巨噬细胞，是中枢神经系统(CNS)中主要的一道免疫防线。

中枢神经系统的发育和维持也依赖于小神经胶质细胞的调控与稳定平衡。去年发表在《Science》上的重磅研究显示，小胶质细胞促成了大脑的发育与维持【1】，足见小胶质细胞对于脑部的重要作用。

小胶质细胞不停地清除着中枢神经系统中的损坏的神经，斑块及感染性物质。无数临床上和神经病理学研究表明激活的小胶质细胞在神经退化类疾病的发病机理中起到十分重要的作用，如帕金森病，多发性硬化和阿兹海默症等。

▶菌群和脑袋◀

在这篇重磅《Cell》文章中，研究者们是如何将肠道菌群和小胶质细胞扯上关系的呢？毕竟一个是在肚子中的微生物，一个是脑袋，这是八竿子打不着的事情。

不要以为把肚子里面的细菌和脑袋联系起来是研究者们异想天开。

事实上，研究者们最开始也仅仅可能是想研究一下小鼠不同发育阶段的小胶质细胞在基因水平上到底有何不同，以及雄性小鼠和雌性小鼠的小胶质细胞到底有何不同。结果发现，雌雄小鼠在不同发育阶段，其小胶质细胞的基因表达或者染色质状态确实有显著差异。

之前已经有多篇研究表明，在自闭症谱系障碍(Autism Spectrum Disorder, ASD )和帕金森（Parkinson’s disease, PD）小鼠动物模型中，清除它们的肠道微生物会进一步加重病情【2,3】。这表明肠道微生物对于大脑的具有重要影响。并且，没有肠道微生物大的无菌小鼠（germ-free mice）的小胶质细胞基因表达出现明显异常【1】。

因此，研究者们也是在前人的基础之上，以及进一步研究验证的情况下，探究到底肠道微生物在不同的性别或者发育阶段过程中对小胶质细胞到底有什么影响。

▶雌雄各不同◀

研究表明，随着发育的不同阶段，肠道菌群对大脑中关键免疫细胞-小胶质细胞（microglia）的影响显著。具体而言，没有肠道微生物的小鼠在胚胎发育过程中其脑袋中的小胶质细胞密度更高，并且，这些小胶质细胞的形态呈现出更多的分叉。

▲上面的图显示，无肠道菌群小鼠的小胶质细胞（图中下面一排绿色表示小胶质细胞）在胚胎发育的16.5天和18.5天明显多于正常有肠道菌群的小鼠（图片来源于Cell）

并且研究还表明，随着发育的不同阶段，这样的影响因性别的不同而不一样。对于雄性小鼠而言，没有肠道微生物的话，其在胚胎发育阶段的小胶质细胞密度比雌性小鼠还要高；而对于雌性小鼠则刚好相反，若是没有肠道微生物的话，雌性小鼠则是在出生之后其小胶质细胞密度比雄性高。

▶有待进一步研究◀

到底肠道微生物是怎样引起脑部的小胶质细胞在雌雄小鼠不同发育阶段的不同的？

这篇研究也仅仅只是从基因转录水平来探讨了一下可能的基因调节网络。然而，肠道中的微生物万万千，种类和数量都相当庞大，究竟又是哪些菌群影响小胶质细胞的呢？而这些菌群又是通过分泌什么物质来达到这种变化的呢？这都还需要继续探究。

并且，还必须注意的是，这篇研究仅仅是小鼠水平的研究。虽然研究者们也探讨了人类胚胎小胶质细胞与小鼠转录组信号明显重叠，从一定程度上说明了人体与动物的这种影响的相似性。

然而，对于人体而言，情况恐怕复杂得多，因为人体中的微生物无论是种类还是数量都远远大于小鼠。

不信的话，你可以看看“一坨翔”是不是都比整个小鼠还大的多！

参考文献：

1. Microglia development follows a stepwise program to regulate brain homeostasis. Science 19 Aug 2016.

2. Hsiao, E.Y., McBride, S.W. et al. (2013). Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell 155, 1451–1463.

3. Sampson, T.R., Debelius, et al. (2016). Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson’s disease. Cell 167, 1469–1480.

导致便秘的三个根本原因

解决问题，首先找到问题最底层的根本原因。没找到根本原因，行动那也是胡来。

声明，这里讨论的只是功能性便秘。

先看看大肠的结构图，了解一下基本术语。

1、粪便的质量不好

分两种，一种是太干，硬的，肠道推不动，这叫干秘，拉得很费劲。

一种不干，但是湿气大，粘粘乎乎的，拉出来不费劲，但总是感觉意犹未尽，犹抱琵琶半遮面，这叫湿秘。

2、肠道蠕动力较弱

这也是导致大便干燥的原因之一。

正常的消化吸收排泄过程，食物从胃到直肠大概需要30小时，但是如果肠道蠕动力不够，行军太慢，那么粪便里面的水分就会被大肠过度吸收，导致太干，更加推不动。

3、没有便意

这是一小部分人才有的。就是吃了很多，根本没有想拉bb的感觉。

便意从哪里来的？粪便行军到直肠的时候，刺激直肠壁发信号给脑神经催你该拉bb了。

有些人喜欢憋屎，憋着憋着这个信号就不起作用了。谁没点脾气？千万不要憋屎。

目标：要改善到什么程度？

有益君不是想给你一个大招，10分钟内、2小时内、1天内怎样怎样。

也不是给你一个奇招，比如每天早上空腹一个冰冻西红柿，每天几个猕猴桃，每天1小时90度控腿……

有益君想给你的是一套纯天然的符合自然生活的方法，努力让你在三个月内回复到正常状态，正常的饮食作息，正常的吃喝拉撒。

慢慢来，比较快。

如何改善粪便质量？

1、放松你的心情

对身体的影响，可以说没什么比心情更重要的。

三国演义中周瑜出计火烧曹操的连锁大船，已经开始执行，有一天忽然发现冬天只有西北风没有东南风，陡然发现计谋有漏洞当时吐血倒下，回去吃什么药都没用。

后来诸葛亮跟他开了一副药方，写着“欲破曹公，宜用火攻，万事俱备，只欠东风。”然后跟周瑜说借他三天三夜的东南风。这病一下子就好了。

我们没有周瑜这种忽然而来的大压力大紧张，但缓慢的小压力总是有的，小压力对身体的影响就是随风潜入夜的慢慢积累。

便秘一直找不到方法，千万不要成天挂在心里，只要去做该做的事情，然后放下心，这样会好很多。事情要做，但心要放下。但行好事，莫问前程，一定会有好结果。这里的好事不是指做善事，而是做正确的事情。

找到有益君，你可以放心了。

放下心来做事，事半功倍，悬着一颗心做事，事倍功半。

2、增加自然饮食中的膳食纤维

这里主要是非水溶性膳食纤维。

对干秘来说，非水溶性膳食纤维会吸收水分，并牢牢抓住水分不让大肠吸走，从而让大便变得柔软。

湿秘，打个比喻，鸡蛋打散了是粘粘乎乎的，加一些韭菜进去就能降低整个蛋液的粘稠度，就容易推动了。

自然饮食中的非水溶性膳食纤维主要来自五谷杂粮、红薯芋头、豆类食品、菌菇类食品、青菜水果等。就是说你必须注意饮食习惯，至少三个月内必须注意。做饭的时候白米中加30%的五谷杂粮，或者放几个红薯芋头，多吃膳食纤维丰富的食材少吃肉。

如果这都做不到，那一定是你还没受够。当然每个人条件不同实际能做到的程度不同，特别是学生党自己做饭不方便，但是也要多想办法尽力而为。

3、补充益生元，调节肠道菌群的平衡

对不方便执行第2条的学生党和工作繁忙的上班族来说，这是一个好消息。

因为益生元是一种纯天然的白色粉末，一天吃个10克到15克就行了，胜在方便。

目前有很多种益生元产品，菊粉、低聚果糖、低聚半乳糖、水苏糖、低聚木糖等，但科学实验和临床实验数据最多证据最充分的还是菊粉和低聚果糖，科学界一致公认的纯天然益生元就是菊粉和低聚果糖，同时也有高品质的生产商。

菊粉和低聚果糖是一种水溶性膳食纤维，第2条说的是非水溶性膳食纤维，因此也能增加粪便含水量，变得更柔软。

同时也是益生元，也就是肠道有益菌的食物，促进有益菌的增殖，产生短链脂肪酸加强肠道蠕动。

关于菊粉和低聚果糖改善便秘的效果。

截止2018年3月12日，有益君52位客户，有5人还没看到效果，其中2人吃了有2个月了，1人吃了有1个月，还有2人吃了2周。其余都是1到2周内见效，而且持续有效。

详细数据请见文章：《苣康元菊粉/低聚果糖用户食用报告-20/03/2018》

每天补充10克到15克益生元，能调节肠道菌群的平衡，对身体的价值不只是改善便秘，还能提高免疫力，降低血脂、胆固醇、尿酸，控制血糖促进矿物质吸收等等。

肠道菌群是一场正在进行之中的医学革命，全球顶尖科学家Jeffrey Gordon和欧洲分子学生物实验室已经证实，包括肥胖、高血糖、慢性腹泻/便秘、抑郁症在内的30多种现代文明病，都与肠道菌群的紊乱相关。

关于肠道菌群、益生元、菊粉和低聚果糖，请参考本公众号以下文章。

菊粉和低聚果糖是什么，对人有什么好处？

如何科学的吃菊粉/低聚果糖？

买菊粉应该知道的7个问题

买低聚果糖应该知道的7个问题

吃菊粉/低聚果糖有没有依赖性？

4、多喝水

喝水不是感觉渴了才喝，而要养成少量多次的喝水习惯。

早上起来一杯温开水，这是必须的，干秘可以加蜂蜜，湿秘就不要加了。接着少量多次，保持一天1500ml到2000ml的饮水量。

一个成人一天需要2500ml的水，包括食物中含的水，蔬菜水果吃得多就少喝一点，否则就多喝一点。

5、加强脾胃功能

脾胃负责消化，肠道负责吸收，这是一个供应链，如果脾胃供应的货不好，也会影响粪便质量。特别是湿秘，多半有些脾虚，要健脾。

可以用经络按摩的方法健脾养胃。按摩太白穴、足三里、合谷穴。

大家都知道好中医难找，所以还是学一下经络按摩的技巧比较好，这东西非常有用，又简单还不花钱，但要掌握这门技术也是要花功夫钻研的。

关于经络按摩的方法和经验，怎么按，什么时间按，按多长时间，怎么才算有效，可以参考这篇文章：《312经络锻炼法——理论认识与锻炼方法》

如何加强肠道蠕动？

1、放松你的心情

请不要嫌我啰嗦，因为真的非常重要。

放下心来做事，事半功倍，悬着一颗心做事，事倍功半。

2、增加自然饮食中的膳食纤维

非水溶性膳食纤维在胃和小肠是不被消化吸收的，能完整的到达大肠，吸水膨胀的膳食纤维增加粪便体积，从而刺激肠道蠕动，加快粪便行军速度。

3、补充益生元，调节肠道菌群的平衡

菊粉和低聚果糖同样是不被胃和小肠消化吸收的，到达大肠后被有益菌发酵代谢，一来增加有益菌数量，有益菌数量多了就会抢占有害菌的地盘，排挤有害菌随粪便排出体外。二来有益菌发酵菊粉和低聚果糖产生短链脂肪酸刺激肠道蠕动，加快粪便行军速度。

有益菌的代谢产物对人体健康带来一系列价值，促进矿物质的吸收、提升免疫力、降低血脂胆固醇尿酸、控制血糖等。

4、肠道顺时针按摩

以肚脐为中心，从肚脐右下角开始沿着肠道圈顺时针按摩，赶着粪便向前走。记住顺时针，方向不要错了。

晚上睡觉前按个100圈，圈完了再按一下整个腹部，如果发现有硬块的地方就多按一会，这是气的郁结，有些是可以慢慢按消失的。

5、全身运动

如果身体条件允许，每天保持一定量的全身运动，特别加强腹部肌肉的运动，仰卧起坐、平板支撑之类的。

年纪大了也要坚持运动，很多时候不是体力问题而是心态问题，觉得这么大年纪了坚持运动怕被人笑话，觉得自己体力不够，心态问题大于体力问题。

如何重新培养便意？

这是针对没有便意的人，吃多少都没有想拉bb的感觉。

当粪便走到直肠的时候，会刺激直肠壁发出信号给大脑神经产生便意，没有便意，那就是这个传输系统出了问题。

没事，我们重新培养建立一个新的系统。便意最强的有2个时间点，早上起床后和饭后。那就找一个你方便的时候重新建立，建议早上起床后。

早上醒了先在床上顺时针给肠道做个按摩，10分钟，跟肠道哥哥/姐姐做个友好沟通表达你的支持与信任，相信你一定行的，不要急，我们一起慢慢努力。

然后起床喝一杯温开水，扭扭腰跳一跳，让水在肠道里荡漾一哈儿，然后到洗手间蹲个5分钟，培养便意。集中精神不要看手机看报纸，5分钟没来就起身。每天坚持。

坚持个一段时间1个月，新的传输系统就建立起来了。

小结：

稻盛和夫说过一句话：“看似平凡的努力最重要。”千万不要瞧不起这些纯天然的日常努力，真正能成大事的正是这些看似平凡的努力，坚持下去定能创造奇迹。

下面会说几个不平凡的奇招，见效更快，但不能从根本上解决问题。

备用急招

当前面的日常努力短期没有看到效果时，比如3天都没拉了肚子胀的难受，这时候你需要一个快速见效的方法来解决急事，可以试试下面的方法。

1、猛吃生蔬菜

芹菜、菠菜、胡萝卜、红薯、苹果，这些能生吃同时膳食纤维多的蔬菜水果，弄一大盘当饭吃，要生的，不要放沙拉酱，放点橄榄油和醋伴着吃。一定要注意胃的接受度，比如有些人红薯吃多了不舒服，这些要注意。

2、控腿

躺在床上，两只腿90度靠在墙上。

当然，如果你有这功夫更好。

药物

成年人保持一周2次排便是需要的。

如果前面方法都不管用，那也可以临时借助药物。泻药，按安全度由高到低推荐如下。

容积性泻剂 

含有天然或合成的多糖或纤维素，通过吸收水分和增大粪便体积而发挥其轻泻作用。如：洋车前子壳、西梅干；

渗透性泻剂 

渗透性泻剂可在肠内形成高渗状态，引起肠道分泌水分，软化粪便。如：聚乙二醇、乳果糖；

刺激性泻剂 

通过改变肠道黏膜对电解质的转运而发挥作用，并且可以增加肠道动力。如：芦荟、番泻叶、大黄。

功能性便秘，从此时此刻开始放下屠刀，做正确的事情，大多数都可以用自然的方法逆转，回归正常饮食正常吃喝拉撒的状态。

遇到有益君，你真的可以放下心来了。

放下心来，傻傻的坚持正确的方法，事半功倍。

1950s：这个阶段我国处于百废待兴的状态，饮食上比较清贫，多以粗粮蔬菜为主，平日的粮食也在50年代后以发的粮票来换取。老百姓的衣食住行，朴素简单。如当时一首民谣所说：“四个兜的中山装，小米高粱吃得香，几户人家一个庄，走亲访友靠步量。

1960s-1970s：此时国家生产力已经得到提升，人们慢慢的由“吃不饱提升到吃不好”。肉食类依然是属于比较精贵的事物，一碗猪油饭成为那个年代大部分人心头萦绕不绝的美味。

1980s：50年代吃不饱60年代吃不好80年代吃得好，到了80年代改革开放后，解放了生产力，国家的生产力已经提升到可以跟的上人们的日常饮食需求了。也可以看到桌子上出现了鸡鸭鱼肉这些“硬菜”了。

1990s：90年代随着下岗潮带来的创业风，各个产业开始丰富成长，曾经少见的“万元户”也慢慢的躲起来，粗粮慢慢淡出桌面，鱼肉开始成为日常饮食中的主要饮食食材。

2000s：千禧年后电子设备的普及，更是我国生活水平提升的一个标志性的物件。与电子设备的一样具有代表性则是食材上的提升。从水里的鸡鸭鱼更提升并包含到牛羊虾类。三高类型饮食结构已经逐渐成型，再加上酒带来的刺激更是进一步促进不健康饮食结构。

2010s：21世纪10年代后，肉食类成为主要饮食，所有素食类以点缀为主，人们口味也逐渐形成肉食类为主（肠道菌群中以肉食为营养来源的有害菌已经占多数）。三高型饮食彻底定型。

从1960s-2010s来看人们的饮食结构已经逐渐形成三高类型饮食结构。肉食类为主的三高饮食结构已经逐渐形成，肠道菌群长期无法得到足量膳食纤维的补充，膳食纤维的动态平衡早已经被破坏。由这份我国的饮食结构变化可以得知大部分人的肠道菌群早已经需要进行调节。这也是近几年来我国肠源性疾病患病比例一直处于增长趋势的原因。

你知道什么是肠道菌群吗？

肠道菌群又被叫做人体第二大脑，医学界曾有这样的术语，即神经胃，主要指胃对胃灼热、气管痉挛这样强烈刺激所产生的反应。

倘若有进一步的不良刺激因素作用，那么胃将根据大脑指令分泌出会引起胃炎、胃溃疡的物质。相反，第二大脑的活动也会影响大脑的活动。比如，将消化不良的信号回送到大脑，从而引起恶心、头痛或者其它不舒服的感觉。

这两个人体的“大脑”是相互影响的，只不过在应对人体的外界刺激时候有相对的先后一样。这两个部位可以理解为两个合伙人，人体就是他们的生意，有外界刺激来影响他们生意时候，他们总有一个先做出来反应对应对外界刺激。

肠道菌群是什么样子呢？

首先肠道菌群并不是从一开始的时候就直接产生与定植的，每个人的肠道菌群都会受到后天环境饮食的影响的，这也是我们可以通过影响肠道菌群来改善人体状况的科学道理依据。关于肠道菌群会受到哪些影响我们会放到《菌群七讲》后面的内容来讲。

肠道菌群生存在我们的肠道内，是由大量细菌构成的菌群团，这些不同群组的细菌共同构建成肠道菌群，一个成年人大概有10万亿个400多种的细菌在体内。

可能光看数字会觉得没有太多感觉，但是要知道我们作为一个地球总共才74亿人左右，而这只是一个人体内的菌群数量。可能有了这笔数量的钱后微博上信小呆才下半辈子下下辈子都不用工作了吧。

肠道菌群中这些细菌又分为有益菌与有害菌和条件致病菌三种。其中因为肠道菌群大量分布在肠壁上，为肠壁穿上一层保护甲，排除外界有害菌的入侵，也为有益菌在体内形成免疫体系而做出保护。

但是总有有害菌会入侵到体内，这也是我们体内有害菌的主要来源，他们可能是通过饮食，地域，生活习惯等等来进入我们的体内，对我们身体造成不良的影响。

目前在肠道菌群的研究中我们知道所有的慢性代谢性疾病、自体免疫疾病、神经系统疾病这些“肠源性疾病”都与肠道菌群的紊乱相关。

根据《Nature》最新的报道显示对于未出身的胎儿是否处于一个无菌的环境中依然存在着争议。2014年Aagaard等人从320名女性的胎盘内部取样，在严格无菌和实验对比下，通过基因测序在部分胎盘中检测出细菌DNA，但德国亚琛工业大学医学微生物学研究所主任MathiasHornef说：“DNA不是细菌”，说，“DNA可以用来表征微生物，但不能断定它的存在。”还有一种说法是实验过程有着无法控制的污染因素在里面。

 Aagaard/MathiasHornef：国外肠道菌群研究者

由于这里还未得到明确的研究结论，我们不做过多阐述。但是胎儿在出身后一定会感染到外界的细菌。感染的过程也不是一瞬间完成的，而是一个逐渐的过程，在这个过程结束时婴儿的肠道菌群完成初步的建立。

而影响到这个建立过程的因素涉及到方方面面，就目前已知的有饮食，地域，周围接触到的人，药物，心理等等。这里注意

如果是正常顺产，其体内微生物群来自母体的阴道；

如果是剖宫产，其体内微生物群来自母体的皮肤环境。

至于这两者之间哪个更好？一般情况下，人体皮肤上是中性细菌多一些，益生菌偏少。所以容易导致刚刚出生胎儿菌群失调导致免疫力低下等。

而顺产婴儿则是通过母亲的阴道以及肛门得到一些益生菌，相对而言可以更快的建立起来肠道菌群。且顺产过程中通过母亲那里可以得到一些有益菌和免疫细胞。

所以单纯的从肠道菌群角度来看待顺产还是剖腹产的选择时应该选择顺产的过程。

关于婴儿肠道菌群第一篇内容就先到这里，下期我们将会介绍一下婴儿饮食上如何影响肠道菌群的建设，比较相比于其他影响肠道菌群的因素，饮食是我们最容易控制的。

PS：如果母亲有特殊情况建议遵照医生建议选择剖腹产还是顺产

部分文章参考自：《河北省科学院学报——肠道菌群的形成及影响因素研究进展仇艳光，王江雁，米 裕，时兰春，孙 芳》

454测序仪读出来的序列是所谓的短标签序列，每个样品有几百条到上千条。每一条经过质控的序列可以代表一个细菌的细胞。两条序列之间的差别不超过3％可以认为它们代表的2个细菌细胞属于同一个“种”。这种由DNA序列归并成的“种”叫作“操作性分类单元”简称OTU。

张晨虹和华蔚颖经过磕磕碰碰的努力，终于拿到了OTU的分布数据，也就是说，按照序列差异不超过3％归并成一个“种”（OTU）的话，一共得到516种细菌在所有小鼠中的丰度分布的数据。

有了这个数据矩阵，张梦晖指导张晨虹，尝试着用各种多变量统计方法观察各组之间的差别。首先，用Rob Knight等人发明的UniFrac方法观察了数据的自然结构，结果显示，饮食的确是影响菌群结构的最重要的因素。然后，用PLS-DA进行分类建模，试着用菌群组成的数据预报一只小鼠吃什么饲料？有没有基因突变？是不是健康（有没有胰岛素抵抗）？经过留一交叉法检验，模型是可靠的，预报的准确率也比较高，然后又用一些统计方法把对分类贡献大的菌群种类挑选出来。我们用挑选出来的关键细菌种类的数据做同样的模型，结果与用516个变量的一样好，说明对分类真正有贡献的变量被挑出来了。

我们一共找到65种细菌，它们在饲料、基因或者健康状况发生变化时会相应地改变自己在肠道里的丰度，而其他的细菌的变化则与我们感兴趣的这几个变量没有什么关联。这是一个数据降维、降噪的过程。也是从一片混沌的数据里找到有意义的规律的过程。

当我们把这65个关键细菌在每只小鼠中的丰度做成热图后，可以看出一些很有意思的现象。首先，在整个菌群中占的比例最大的是一个叫做丹毒菌科的“科”。属于这个科的关键变量又分成M1－4共4个组，M1组在健康肠道里很多，可以占到总菌量的20％左右，不过，只要动物有了胰岛素抵抗（不管是基因突变引起的，还是高脂饲料引起的，也不一定要伴随有肥胖），这类菌的数量就降到1％以下；M3在吃普通饲料的小鼠肠道里可以占到总菌量的40％以上，在吃高脂饲料的肠道里会降到1％以下；M2和M4则只在吃高脂饲料的肠道里特别多。M2、3、4的丰度变化只与饲料类型有关，与基因是否突变和动物是否健康都没有关系。因此，肠道里占大多数的细菌的数量波动可能只与吃什么有关系，与健康关系不大。假如直接去测整个菌群的序列，发现的基因大部分恐怕与健康关系不大，反而会干扰我们找到与健康真正有关系的细菌和它们的基因。

2008年，戈登实验室发表一篇小鼠的论文，主要是通过转换饮食，先喂高糖、高脂的西方膳食，肥胖以后，再改成普通饲料，连续采样，观察菌群的变化规律。他们发现厚壁菌门里有一个纲的细菌在吃西方膳食肥胖以后数量增加的特别高。他们也测定了一个来自于人的肠道的属于这个纲的细菌的基因组，发现有很多基因与利用碳水化合物有关系。因此，他们推测，这个在他们论文里叫做柔膜菌纲的细菌类型在肠道里增加以后，可能会促进消化吸收各类膳食纤维，增加动物对热量的吸收，从而促进肥胖的发生。这个工作是第一次看到厚壁菌门在肥胖动物肠道里的升高不是整个门的细菌的行为，而是其中一个纲的升高造成的。

对比一下序列，就会发现，戈登实验室论文中的柔膜菌纲其实就是我们这个工作中发现的丹毒菌纲。所谓柔膜菌纲，是因为这个纲里有一些细菌是没有细胞壁的。不过，后来把没有细胞壁的类型移到了另外一个门，剩下的组成了丹毒菌纲。我们发现在小鼠肠道里丰度最高的是这个纲的一个科叫丹毒菌科。由于细菌的分类地位常常会发生调整和变动，咋一看，读者还以为我们看到的丰度最高的细菌与戈登实验室看到的是不同的东西，其实它们是同一类东西，只不过叫的名字有了变化，戈登实验室在发表时没有及时用新的名称而已。

与戈登实验室认为肥胖动物的肠道菌群是整个柔膜菌纲（丹毒菌纲）的丰度在升高不同的是，我们看到这个纲的丹毒菌这一个科才是真正丰度最高的类型，而且，在同一个科里的关系很近的细菌，依然对健康和饲料的变化表现出不同的反应。这就提示我们，研究肠道菌群与动物健康的关系，以及想了解什么样的因素会影响肠道菌群的组成进而影响动物和人体的健康，就不能在“门”这样的分类单元上进行，要细分到“科”以下的单元，以“属”和“种”为单位才行。

在我们的这次试验里找到的65个关键细菌里，还发现双歧杆菌在饲喂高脂饲料6个月后，无论动物是什么基因型，都检测不到了。可能长期的高脂饲料不能给需要膳食纤维的双歧杆菌提供营养，最后造成这类菌生长速度低于排空的速度，最后就被淘汰光了。

更有意思的是：我们发现脱硫弧菌科里有一个菌，在病得最重的“好基因＋坏饲料”的组合里，丰度最高，是“好基因＋好饲料”组合的7倍还要多。

大量研究报道，双歧杆菌对肠道屏障有保护作用。这类菌如果被排空了，动物肠道的通透性可能就会升高，也就是说：肠子开始有点漏了，肠道里的乱七八糟的毒素就容易进入血液。脱硫弧菌科里的细菌是所谓的“硫酸盐还原菌”，它们可以把硫酸盐还原成有致癌活性和腐蚀性的硫化氢，另外，这些菌是条件致病菌，它们的细胞壁上的脂多糖具有很强的内毒素活性，进入血液可以诱发炎症。因此，双歧杆菌的减少乃至被排空、条件致病菌的丰度上升，可能会造成肠屏障功能下降、内毒素进入血液而诱发慢性炎症、推动代谢损伤的发展。这个推论与喀尼等人发表的系列论文是呼应的。所不同的是，我们把目光聚焦到了一些具体的细菌种类上。为下一步的深入研究，确认它们的功能，指明了方向。

这个工作可以说有很多与前人不一样的发现，但这些发现都“makesense”，可以与前人发表的结果有一个整体的呼应。可以看出，我们的工作是更多地在沿着喀尼等人指出的“代谢性内毒素血症”的方向前进的，而对戈登实验室的F／P比值与肥胖的关系是有挑战和质疑的。

这个工作写成论文以后，投了多家杂志都被拒稿，主要是审稿人中有不分青红皂白就一口否定的，怎么讲道理都不行，他就是不信我们的结果，或者，他认为这个问题已经有结论了，我们的发现没有新颖性，其实他根本就不看我们的结果与已经发表的主流看法差距很大，不是一回事。这篇稿子从PloS Biology审稿3个月退稿，到Journal of Molecular Medicine审稿2个月退稿，到Gastroenterology审稿两个月退稿，一连串的退稿让张晨虹很是郁闷，在我的鼓励下，她打起精神，又把稿子投给我们微生物生态学领域的最好的ISME Journal。这回的待遇好多了，一审评价整体不错，也提了不少意见，编辑同意修改以后再投回去。我们做了非常仔细的修改，写了很长的信给编辑，逐条解释回答审稿人的意见和我们的回应以及修改。论文再次投回去以后，过不久就被接受了。

论文发表以后，反响还不错，记得有一次开会见到了德国著名的微生物生态学家司马拉教授，她第一句话就是“Liping, I enjoyed reading your new paper! Its so interesting!”。这些话，是对一个科学家和他的学生们工作的最好的奖赏！

我们的论文发表前后，有不少在人群和动物中的工作发表，指出无法重复戈登实验室F/P比值与肥胖关系的结果，甚至得出相反的结果。当然，也有不少论文报道了与戈登实验室发现一致的结果。还有不少实验室甚至发展测定F／P比值的方法，用于肥胖与菌群关系的研究。

这个争论可能还要持续好多年。支持还是不支持F/P比值与肥胖的关系几乎成了肥胖与菌群关系研究领域一个“站队”的标志。我以很平常的心态对待这个争论，戈登教授本人也很平和。我始终认为，戈登教授对肥胖和菌群关系的研究的贡献具有划时代的意义。至于F/P比值，我认为他肯定是当时限于技术和经验，结论下的有点早了，不够确切，被后来的研究逐步修正是不可避免的，但这并不能丝毫损伤他的贡献的意义。我所有的文章和报告里，都对戈登教授的工作给予恰当的评价和肯定。2010年9月在圣路易斯召开的人类微生物组会议上，我和戈登教授第一次见面。我们两个人的报告被安排在一个会场里先后讲。他讲完以后，坐在第一排听我讲。我讲完下来后，他第一个站起来，走过来与我握手，并说：I am admirer of your work. 我也赶紧说：I am your fan!然后，两人会心的相视一笑。

F/P比值与肥胖有关系的结论发表在Nature上，其影响力是很深远的。特别是没有微生物背景的医学领域的同行，如果想进入菌群与肥胖关系研究领域，往往第一步先从分析F/P比值开始。这个工作是人类探寻什么样的菌群组成特征与肥胖有关系，而且希望是因果关系的最早的努力！不过，把菌群与肥胖的关系定位到两个门的比值以后，就使很多人，包括戈登实验室放弃了寻找对肥胖发生贡献大的具体细菌种类的努力，这是非常可惜的。如果要继续沿着F/P比值的发现继续深入研究的话，就要发现戈登教授在他们的Nature论文里讲的“一个门里所细菌共有的与肥胖有关的功能”，可惜，这个功能如果不存在的话，一个学生再努力都是白搭。2012年11月，我参加美国微生物学会的有益微生物学术会议，并做了大会开幕式报告。报告结束后，戈登教授的一个博士生来找我聊天，她告诉我，她现在是他们实验室唯一一个做肥胖的博士生了。为什么会这样呢？我想有不少原因，其中一个是他们实验室关于肥胖的结果已经在 2006年同一期Nature发表了2篇论文，后面的学生要想超越这个高度是很难的；另外，F/P比值与肥胖的关系如果不存在，当然会让后面的学生无法深入下去研究其机理。凡此种种，出现后面的学生不愿意做肥胖的局面，也就可以理解了。

对我们实验室来说，我要“咬定青山不放松”，而且是至少20年不放松！我坚信是一些具体的细菌种类直接参与了肥胖的发生发展，而不是一些高级别的分类单元或者它们的比值与肥胖有关系。作为一个靠分离培养细菌过日子的微生物学家，找到具体的可能参与了肥胖发生过程的细菌，把它们的代表菌株分离出来，对其致病作用加以验证，对其作用机理加以阐明，成为我梦寐以求的事情！我常常对学生们说，找不到这些细菌，我“死不瞑目”啊！

当然，我们要找的肥胖细菌应该是从人的肠道里来的，而不是小鼠的。如果大家都用小鼠做模型研究菌群与肥胖的关系，想找到人体肠道里的肥胖细菌岂不遥遥无期？

要做人的研究谈何容易啊！摸着自己足足有3尺3寸腰围的大肚子，我暗下决心，先从自身开始，看看菌群与肥胖到底有没有关系？如果通过改变菌群能把自己的体重减下来，就想办法去做临床试验，来寻找人体肠道与肥胖相关的细菌。

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这种情况，建议口服ALLER-5抗过敏益生菌,可以修复皮肤，减少毛囊堵塞，对身体没有其他副作用。

孕妇作为一个特殊人群，不仅关心自己的健康，更应关心胎儿健康。并且孕妇服用益生菌，已被科学证明对母婴双发都有积极意义，孕妇与乳母服用益生菌是预防儿童湿疹的安全有效方式。

一项105位孕妇（本人或胎儿生父曾被诊断为过敏性哮喘，鼻炎或湿疹）进行的随机，双盲，安慰剂对照试验，在分娩前2-5周每日服用含有鼠李唐乳杆菌HN001益生菌膳食补充剂，连续服用至产后6个月，其新生儿从出生服用至2岁，并在2，4，6岁时分别检测湿疹发生率。

结果表明：经HN001干预后，幼儿2岁时遗传过敏性湿疹症状显著减轻，湿疹发病率降低了49%，4年内减低鼻炎与红眼病患病风险62%，6年累计减低湿疹发生率44%；仅在生命前2年补充HN001，对湿疹预防作用可延续到6岁。

结论：HN001对6岁时高危婴幼儿湿疹和鼻炎的发展以及可能的特英性致敏作用方面起到有效的预防作用。

ALLER-5，精选5种具有不同部位定值优势的特定医用级益生菌菌株，经过优选驯化，耐胃酸，耐胆汁，易附着于肠道，并搭配两种益生元，相辐相成，帮助提高免疫力与抗过敏能力。

ALLER-5中就包含了

鼠李唐乳杆菌HN001

乳双歧杆菌Bi-07

嗜酸性乳杆菌 NCFM

罗伊氏乳杆菌GL-104

副干酪乳杆菌Lpc-37

5种益生菌。

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在益生菌市场快速扩张的情况下，中国益生菌研究滞后、菌种依赖于进口的情况也受到市场关注，在这种情况下，国内技术人员也开始在研发上开始发力。

益生菌的称呼源于希腊语。目前，益生菌广泛应用于医疗健康、食品工业、动物健康养殖、农业种植等领域，市场增长显著。

根据科拓恒通益生菌领域专家马晨博士介绍的行业数据，至2015年，中国益生菌的市场规模就已经达到480多亿，预计到2022年，中国益生菌市场的规模可能增长到850亿。

在市场不断扩大的同时，行业的隐忧也日趋引发关注。一方面，中国益生菌产业缺乏最核心的菌株资源。大型企业发酵乳制品菌种几乎全部依靠进口，不仅生产成本高，更重要的是制约了乳酸菌产业和发酵乳制品发展。

另一方面，研发在外的情况也制约了益生菌的效用。马晨博士解释说，一方水土养一方人，来自欧洲的菌种常年累月接触的是欧洲人的食物谱系，这样的菌种用于其他饮食结构的人群，效用就会出现折扣。因此，本土化的菌种研制势在必行。

在这种情况下，国内的研究者们也开始动了起来。马晨博士介绍说，中国益生菌的历史非常悠久。比如牧民自制酸马奶中就含有益生菌，在蒙医、藏医中酸马奶都作为药引子使用。上世纪80年代，国内也开始对益生菌进行科学研究。

为了推动中国益生菌科技发展，国内科研团队已经寻“种”多年。益生菌的品质与它生存的环境息息相关，为找到表现优异的益生菌菌株，科研团队采集样本的地方往往人迹罕至、交通不便，这样保证了较少受到工业污染。

目前，依托自主创立的优良菌株筛选技术和评价体系，国内的研究团队已经先后采集筛选出干酪乳杆菌Zhang、乳双歧杆菌V9、植物乳杆菌P-8等中国自有原创益生菌菌株，在技术上取得突破。

不过马晨博士提醒说，从一个实验室的结果，变成一个商业化的商品，还有很多的困难徐亚突破，中国益生菌的研究和推广，仍需要持续的努力。